Иоанна родилась в Толедо, столице королевства Кастилия. Она была третьим ребенком и второй дочерью Католических монархов — Фердинанда Арагонского и Изабеллы Кастильской, чей брак стал началом фактического объединения раздробленной Испании. Как и других девушек из царствующих семейств, иоанну готовили к династическому браку, который должен был укрепить положение королевства, усилить его влияние и вес на международной арене. Иоанна не считалась серьезной претенденткой на трон Кастилии или Арагона, однако в результате стечения обстоятельств унаследовала оба.
В 1496 году в возрасте 16 лет Иоанна была выдана замуж за эрцгерцога Филиппа Австрийского, наследника Бургундского государства. Этот брак лег в основу династического союза Испании и дома Габсбургов, направленного против Франции. Однако семейная жизнь Филиппа и Иоанны не была благополучной - многочисленные измены мужа и его ветреность, помноженные на ревность инфанты, привели к тому, что Иоанна периодически впадала в состояние депрессии, переходящей во вспышки бешеной ярости. Поползли слухи о нестабильном психическом состоянии инфанты.
В 1497 году неожиданно скончался брат Иоанны — инфант Хуан Астурийский. После этого наследницей была избрана следующая по старшинству принцесса — Изабелла Астурийская. Но в 1498 она скончалась во время родов. Рождённый ею младенец — Мигель, короткое время был наследником трёх корон — отцовской португальской и обеих испанских. Но ребёнок умер в 1500 году, а следующей по старшинству оказывалась Иоанна. В 1502 г. Изабелла, королева Кастилии, мать Иоанны, составила завещание, согласно которому она назначала дочь своей единственной наследницей в Кастилии. Но особо оговаривала, что государством от имени дочери будет управлять и править её отец Фердинанд II, в том случае, если та окажется недееспособной. Зять, Филипп Австрийский, в последней воле Изабеллы упомянут не был. После смерти Изабеллы Кастильской в 1505 г. кортесы, согласно вышеописанному документу, признали Иоанну королевой Кастилии. Но её супруг Филипп объявил, что регентом новоиспеченной королевы будет все-таки он, а не её отец Фердинанд. После долгих препирательств и споров, в 1506 году Филипп и Фердинанд подписали соглашение, что психическое состояние Иоанны не позволяет ей править и что ни при каких обстоятельствах ей не будет позволено управлять страной.
Но не прошло и года, как осенью 1506 Филипп внезапно заболел и умер. Неожиданную смерть Филиппа связывали, в том числе, и с отравлением. Говорили, что приказ отдал Фердинанд. Смерть мужа сильно подействовала на Иоанну: она не отходила от его тела, долгое время противилась похоронам, потом впала в сильную депрессию, с временными приступами бешенства, которые делали необходимым за ней постоянный надзор. При этом она была на последних месяцах беременности, что усугубляло её состояние. В Кастилии воцарилась анархия. Король Фердинанд был спешно призван из Арагона, чтобы взять бразды правления в свои руки. Филиппа похоронили. А Иоанну в 1509 году по распоряжению отца отправили в замок Тордесильяс под неусыпный надзор.
Её отец умер в 1516 году, после чего управлять Кастилией (и вдобавок и Арагоном) стал её сын Карлос (Карл V), будущий император. Посетив свою мать в замке Тордесильяс, Карл убедился в том, что состояние Иоанны неуклонно ухудшается - она испытывала затруднения с тем, чтобы есть, спать, мыться и менять одежду, а также была убеждена, что монахини хотят ее убить. Известны строки письма, написанные Карлом: "Мне кажется, самой нужной и необходимой вещью будет, чтобы никто не мог увидеть Её Величество. Потому что ничего хорошего из этого выйти не может".
После десятков лет убогого затворнического существования, она умерла 12 апреля 1555 года, в возрасте 76 лет.
